Jeśli potrzebujesz więcej informacji lub pomocy zadzwoń – 510 10 34 73 lub 605 110 704

Dla lekarzy

Badania nad stresem glikacyjnym

Wersja online: ISSN 2188-3610

Wersja drukowana: ISSN 2188-3602

Otrzymano: 26. października 2015

Zatwierdzono: 21. listopada 2015

Opublikowano online: 31. grudnia 2015

 

Artykuł oryginalny

Ocena in vitro zdolności kwasu rozmarynowego do rozbijania wiązań AGE

Daniel Jean 1), Maryse Pouligon 1), Claude Dalle2)

1) Institut des Substances Vegetales, Beaumont, Francja

2) Światowe Towarzystwo Medycyny Anti-Aging, Paryż, Francja

Abstrakt

Cel: Pomimo iż przeprowadzono wiele prac badawczych oceniających zdolność różnych cząsteczek do rozbijania zaawansowanych produktów glikacji białek (AGE), to, według naszej najlepszej wiedzy, żadne z nich nie zostało przeprowadzone w celu oceny zdolności tych cząsteczek do rozbijania poprzecznych wiązań białkowych rozpatrywanych globalnie. Celem niniejszej pracy było wyraźne pokazanie polimeryzacji albuminy wywołanej reakcją z rybozą oraz zdolności kwasu polifenolowego pochodzącego z rozmarynu (Rosmarinus officinalis) – kwasu rozmarynowego – do rozbijania polimerów albuminy.

Metody: Albumina została glikowana za pomocą inkubacji rybozą a wynikłe polimery albuminy zostały ocenione za pomocą chromatografii żelowej (SEC, ang. „size exclusion chromatography”) oraz fluorymetrii. Po wyeliminowaniu rybozy za pomocą dializy białka poddano działaniu kwasu rozmarynowego, aminoguanidyny, karnozyny oraz Alagebrium (ALT-711; Alteon), jako kontrolę dodatnią. Odwrócenie procesu glikacji zmierzono za pomocą stosunku pomiędzy albuminą spolimeryzowaną i czystą przed i po poddaniu jej działaniu cząsteczek odwracających proces glikacji.

Wyniki: Okazało się, że kwas rozmarynowy rozbija wiązania tak samo dobrze, jak Alagebrium. I odwrotnie, aminoguanidyna i karnozyna, inhibitory reakcji glikacyjnej, nie powodują istotnego odwrócenia polimeryzacji albuminy.

Omówienie: Polimeryzację albumin wywołaną glikacją przy pomocy rybozy można mierzyć za pomocą chromatografii żelowej oraz fluorymetrii utworzonych polimerów. Wykazaliśmy, że kwas rozmarynowy może odwrócić polimeryzację w podobnym zakresie, co Alagebrium.

Wnioski: Kwas rozmarynowy wydaje się być obiecującą cząsteczką, o której wiadomo, że jest w stanie bezpiecznie rozbić poprzeczne wiązania białkowe związane z AGE mniej więcej tak samo dobrze, jak Alagebrium, które dotąd uważane było za cząsteczkę referencyjną w tej dziedzinie. Stanowi obiecujące leczenie cukrzycy, procesów starzenia się skóry oraz chorób związanych z upośledzeniem funkcjonowania naczyń krwionośnych z powodu starzenia się takich, jak nefropatia, neuropatia i retinopatia.

SŁOWA KLUCZOWE: zaawansowane produkty glikacji białek (AGEs), kwas rozmarynowy, wiązanie, „rozbijacz” AGE.
 

Wprowadzenie

Białka, rodniki azotu oraz cukry redukujące biorą udział w tak zwanej reakcji Maillarda, odpowiadającej za tworzenie produktów skondensowanych, której mechanizm został po raz pierwszy opisany w 1953 roku przez Hodge’a. Zaawansowane produkty glikacji białek (AGE) to ostateczny produkt złożonej reakcji chemicznej nieenzymatycznej prowadzącej do utworzenia wewnatrz- i międzycząsteczkowych wiązań poprzecznych pomiędzy sąsiadującymi białkami upośledzając ich funkcjonalność i zmieniając właściwości fizyczne2,3). Sieciowanie białek to mechanizm patofizjologiczny, który uznano za czynnik sprawczy powikłań cukrzycy oraz chorób związanych z wiekiem4) takich, jak nefropatia, retinopatia, upośledzenie funkcjonowania naczyń krwionośnych oraz utrata elastyczności skóry. U osób zdrowych funkcjonalne właściwości białek pogarszają się powoli z wiekiemS). U pacjentów cukrzycowych akumulacja AGE oraz sieciowanie białek są przyspieszone ze względu na wysokie stężenie glukozy6).

Metody leczenia obejmują zapobieganie tworzenia AGE poprzez lepszą kontrolę poziomu cukru we krwi u osób z cukrzycą oraz/lub stosowanie inhibitorów AGE oraz „rozbijaczy” AGE, cząsteczek zdolnych do rozbicia poprzecznych wiązań białkowych związanych z AGE. Obecnie znane są liczne cząsteczki zdolne zahamować proces glikacji in vivo i in vitro7), na tym lub innym etapie, prowadząc do powolnej redukcji liczby glikowanych białek, głównie białek o średnim i szybkim metabolizmie. Inhibicja jest o wiele mniej skuteczna w białkach o powolnym metabolizmie, jak kolagen w skórze, stawach lub elastyna w ścianach aorty. Odkrycie bezpiecznych cząsteczek zdolnych do rozbicia poprzecznych wiązań białkowych związanych z AGE stanowiłoby znaczny postęp w kierunku poprawy stanu zdrowia związanego z wiekiem i cukrzycą.

Jednym z głównych problemów ze znalezieniem takich cząsteczek jest to, że poprzeczne wiązania białkowe związane z glikacją oparte są na licznych cząsteczkach, z których tylko kilka8) to pentozydyna, glukozepan i dimer lizyny metyloglioksalu (MOLD). Zatem mało prawdopodobne jest znalezienie uniwersalnego „rozbijacza” wiązań poprzecznych AGE zdolnego rozszczepić wszystkie poprzeczne wiązania związane z glikacją. W 1996 roku doniesiono o pochodnej tiazolu – Alagebrium lub ALT-711 (Alteon Inc., Montvale, New Jersey, USA), która okazała się silnym „rozbijaczem” wiązań poprzecznych AGE9), bez opisywania typu wiązań poprzecznych rozbijanych przez tę cząsteczkę. Później, w 2013 roku wykazano, że cząsteczka jest w stanie rozbić związki α-dikarbonylowe obecne w produktach Amadori przed uformowaniem wiązań poprzecznych10).

 Międzycząsteczkowe sieciowanie białek prowadzi do polimeryzacji białek11). Stopień polimeryzacji po reakcji białek z cukrem redukującym można uznać za globalny marker sieciowania związanego z AGE. W niniejszej pracy opisujemy metodę in vitro oceny szybkości sieciowania AGE w albuminie oraz pokazujemy, że kwas rozmarynowy (Rys. 1) wykazuje zdolność rozbijania poprzecznych wiązań białkowych związanych z glikacją.

 

 

Rys 1. Budowa kwasu rozmarynowego.

Wzór cząsteczkowy: C18H16O8; ciężar cząsteczkowy: 360,3.

Materiały i metody

Przygotowanie glikowanej zsieciowanej albuminy

Użyto następujących odczynników i materiałów: surowicza albumina wołowa (BSA) frakcja V o czystości ≥ 96% firmy Sigma (Sigma A9647, St. Louis, Missouri, USA); D (-) ryboza, czystość min. 99,0 % (Sigma R7500); kwas octowy 99,8 % (Acros nr 222140010, Acros Organics, Geel, Belgia); woda amoniakalna (A.C.S. Sigma-Aidrich 22,122-8); rurka do dializy, pokryta benzoilem, średnia, płaska, szerokość 32 mm (1,27 cala) (Sigma D7884); Sephadex G-50 (Sigma G-50-80).

Glikacja albuminy

Roztwory przygotowano w następujących warunkach: BSA, 24 % (w/w) w roztworze buforu octanu amonu przy pH 7,4 oraz roztwór rybozy, 30 % (w/w) w octanie amonu przy pH 7,4. Następnie 250 g roztworu BSA wymieszano z 50 g roztworu rybozy, wysterylizowano poprzez filtrację na 0,2 µm membranie i pozostawiono na 6 dni w temperaturze 37°C. Glikowany roztwór BSA został poddany dializie wobec wody przez 4 dni w temperaturze pokojowej w celu usunięcia rybozy i zatrzymania reakcji glikacji.

Chromatografia żelowa (SEC)

Dializowany roztwór BSA został oczyszczony za pomocą SEC na żelu Sephadex G50 w roztworze buforu octanu amonu przy pH 7,4. Zgromadzono frakcję w kolorze pomarańczowo-brązowym.

Określanie szybkości sieciowania albuminy

Użyto następujących odczynników i sprzętu do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC, ang. "high-performance liquid chromatography"): woda do HPLC Chromasolv Plus (Sigma-Aidrich 34877); system Waters Integrity z detektorem fluorescencyjnym (Hewlett Packard, Palo Alto, Kalifornia, USA); Detektory rozpraszania światła przez odparowanie (ELSD, ang. „Evaporative Light-Scattering Detectors”) o niskiej temperaturze parowania (Sedex 55; SEDERL, Alfortville, Francja); kolumna do HPLC (TSK Gel Super SW3000; Tosoh Bioscience, Tokio, Japonia). Warunki analizy były następujące: prędkość przepływu 0,3 ml/min; temperatura kolumny 25°C ; izokratyczna 24 min; roztwór buforu octanu amonu, pH = 6,0; kwas octowy 0,5 ml; woda ad 100 ml; woda amoniakalna, ad pH = 6,0; detekcja długości fal; fluorescencja (wzbudzenie 335 nm; emisja 385 nm); iniekcja 10 µm próbek rozcieńczonych wodą 1/2,5 (v/v).

Obliczanie prędkości sieciowania BSA oraz zdolności cząsteczek do rozbijania wiązań poprzecznych

Glikacja albuminy przy pomocy rybozy wywołuje polimeryzację albuminy. Polimery złożone są następnie rozdzielane i ocenianie globalnie z całkowitej powierzchni pików odpowiadających różnym polimerom. Względne stężenie polimerów BSA otrzymuje się przez obliczenie współczynnika ich obszarów na chromatogramie.

Att, Ate =    Całkowity obszar białek przed i po poddaniu działaniu potencjalnego „rozbijacza” wiązań poprzecznych.

Agt, AGe=   Całkowity obszar polimerów białkowych (usieciowana BSA) przed i po poddaniu działaniu potencjalnego „rozbijacza” wiązań poprzecznych.

Tg =                       wskaźnik sieciowania glikowanej BSA przed i po poddaniu działaniu potencjalnego „rozbijacza” wiązań poprzecznych (Tg = Agt/Att).

Eg =                       wskaźnik sieciowania glikowanej BSA przed i po poddaniu działaniu potencjalnego „rozbijacza” wiązań poprzecznych (Eg = Age/Ate).

Zdolność procentowa rozbijania wiązań poprzecznych potencjalnego „rozbijacza” podana jest wzorem:

Dg = ((Tg/Eg) x 100)).

Zdolność cząsteczek do rozbijania AGE

Użyto następujących próbek: Alagebrium (Alteon); L-karnozyna (Sigma-Aidrich nr C9625); wodorowęglan aminoguanidyny (Sigma-Aidrich nr 109266); kwas rozmarynowy (Sigma-Aidrich nr R4033).

Wyniki

Zdolność badanych cząsteczek do rozbijania sieciowania pokazuje Tabela 1 i wykres na Rys. 2.

Omówienie

Po reakcji z rybozą albumina zostaje spolimeryzowana, jak pokazuje SEC. Odsetek (%) monomerów zostaje przekształcony w polimery. Taka polimeryzacja staje się z czasem stabilna i można ją odwrócić przy pomocy Alagebrium i kwasu rozmarynowego – oba przywracają po 50% monomerów biorących udział w polimeryzacji. Czysty kwas rozmarynowy pozyskuje się z rozmarynu (Rosmarinus officinalis).

Niniejsze wyniki pokazują, że Alagebrium, poza zdolnością do rozbijania α-dikarbonylowych rodników AGE, wykazuje również zdolność do rozbijania preform usieciowanych albumin powiązanych z AGE. Kwas rozmarynowy ma w przybliżeniu te same wyniki wykazując, że cząsteczka naturalna o od dawna i dokładnie udokumentowanym bezpieczeństwie jest w stanie odwrócić, przynajmniej in vitro, sieciowanie białek, które jest źródłem mechaniczno-strukturalnych właściwości i utraty funkcjonalności białka glikowanego.

 

Zdolność kwasu rozmarynowego do rozbijania wiązań AGE

Tabela 1. Zdolność do rozbijania wiązań.

Badane cząsteczki

Zdolność do rozbijania wiązań

Wartości P

Doświadczenie kontrolne „kontrola”

3,18%

 

 

Alagebrium

46,38%

 

<0,001

 

Karnozyna

-2,73%

 

0,345

 

Wodorowęglan aminoguanidyny

9,12%

 

0,072

 

Kwas rozmarynowy

52,66%

 

< 0,001

 

Wartości P, wartości prawdopodobieństwa porównane z kontrolą, badanie Studenta t, n = 3.

 

 

% rozbicia

 

 

Kontrola

Alagebrium

Karnozyna

Wodorowęglan aminoguanidyny

Kwas rozmarynowy

 

 

Rys. 2. Zdolność do rozbijania wiązań poprzecznych.

Słupki wskazują odchylenie standardowe. Liczba pomiarów n = 3.

 

Wnioski

Kwas rozmarynowy to produkt naturalny dobrze znany ze swego bezpieczeństwa. Wykazaliśmy, że możliwe jest odwrócenie sieciowania powiązanego z AGE oraz że mogłoby to stanowić skuteczne leczenie cukrzycy, procesów starzenia się skóry oraz chorób związanych z upośledzeniem funkcjonowania naczyń krwionośnych z powodu starzenia się takich, jak nefropatia, neuropatia i retinopatia, by wymienić tylko kilka z nich.

Podziękowania:

Część niniejszego badania została zaprezentowana na XIII Międzynarodowym Kongresie Medycyny Estetycznej i Anti-Aging, który odbył się 28. marca 2015 roku w Monako.

Oświadczenie o braku konfliktu interesów

Niniejsze badanie zostało częściowo obsłużone przez A2P Nacriderm Laboratories, Lyon, Francja.

 

Bibliografia

  1. Hodge JE. Dehydrated foods: Chemistry of browning reactions in model systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1953; 1; 928-943.
  2. Verzijl N, DeGroot J, Oldehinkei E, et al. Age-related accumulation of Maillard reaction products in human articular cartilage collagen. Biochem .1. 2000; 350; 381-387
  3. Guitton JD, Le Pape A, Sizaret PY, et al. Effects of in vitro glucosylation on type-I collagen fibrillogenesis. Biosci Rep. 1981; 1: 945-954.
  4. Brownlee M. The pathological implications of protein glycation. Clin Invest Med. 1995; 18: 275-281.
  5. Nowotny K, Jung T, Grune T, et al. Accumulation of modified proteins and aggregate formation in aging. Exp Gerontol. 2014; 57: 122-131.
  6. Shah S. Baez EA, Felipe DL, et al Advanced glycation endproducts in children with diabetes. J Pediatr. 2013; 163: 1427-1431.
  7. Monnier VM. Intervention against the Maillard reaction in vivo. Arch Biochem Biophys. 2003; 419: 1-15.
  8. Sell DR. Monnier VM. Molecular basis of arterial stiffening: Role of glycation-a mini-review. Gerontology. 2012; 58: 227-237.
  9. Vasan S, Foiles P, Founds H. Therapeutic potential of breakers of advanced glycation end product-protein crosslinks. Arch Biochem Biophys. 2003; 419: 89-96.
  10. Kim T, Spiegel DA. The unique reactivity of N-phenacyl-derived thiazolium salts toward α-dicarbonyl compounds. Rejuvenation Res. 2013; 16: 43-50.
  11. Perera HK. Handuwalage CS. Analysis of glycation induced protein cross-linking inhibitory effects of some antidiabetic plants and spices. BMC Complement Altern Med. 2015; 15:175.

Age Breaker PAKIET 4 sztuki

Jędrność, blask, ogólna poprawa zdrowia
1280.00zł

Nacriderm HYDRATANT AR

Do skóry wrażliwej, naczynkowej
170.00zł

Nacriderm WHITE

Krem rozjaśniający przebarwienia
170.00zł

Age Breaker

Jędrność, blask, ogólna poprawa zdrowia
340.00zł

Sun Breaker SPF50

Bardzo wysoka ochrona SPF 50+
160.00zł

Age Breaker Creme

Jędrność,blask
195.00zł